Bagaimana pemisahan dapat terjadi dalam kromatografi?

Jika kita mempunyai campuran senyawa, kita dapat memisahkan campuran senyawa tersebut menjadi komponen-komponennya. Tapi mengapa ya komopnen-komponen campuran senyawa tersebut dapat terpisah dengan kromatografi?

Gambar 1 menunjukkan pemisahan hipotetik dari tiga komponen campuran dalam kolom LC. Setiap molekul diwakili oleh segitiga untuk senyawa A, bujur sangkar untuk senyawa B dan lingkaran untuk senyawa C. Empat langkah yang berturutan dalam pemisahan dimulai dari (a) dengan aplikasi sampel dalam kolom kering. Dalam LC moderen kolom selalu dibasahi terlebih dahulu sebelum sampel diinjeksikan; kolom kering ditunjukkan disini untuk penggambaran yang lebih baik dari proses pemisahan.

Pada langkah (b) pelarut atau fase gerak mulai mengalir melewati kolom, menghasilkan gerakan molekul sampel sepanjang kolom dan mulai terjadi pemisahan parsial dari komponen A, B, dan C. Gerakan pelarut melewati kolom selanjutnya ditunjukkan oleh langkah (c) dan langkah (d) yang menujukkan ketiga komponen tersebut telah terpisah satu sama lain.

 

Gambar 1. Proses pemisahan dalam kolom kromatografi

Pada langkah (d) dari Gambar 1, kita bisa mengenali dua karakteristik pemisahan kromatografi, yaitu migrasi difrerensial dari berbagai komponen (solute) dalam sampel serta penyebaran yang terjadi sepanjang kolom dari molekul-molekul setiap senyawa yang berbeda.

Dalam Gambar 1, senyawa A bergerak paling cepat dan meninggalkan kolom pada urutan pertama, senyawa C bergerak paling lambat dan meninggalkan kolom pada urutan yang terakhir. Sebagai hasilnya, senyaw A dan C secara bertahap terpisah pada saat mereka bergerak melewati kolom. Migrasi diferensial merupakan dasar pemisahan dalam kromatografi, tanpa adanya perbedaan dalam laju migrasi untuk dua senyawa, pemisahan tidak mungkin terjadi.

Migrasi diferensial dalam LC adalah hasil dari kesetimbangan distribusi dari senyawa-senyawa yang berbeda, seperti A, B, dan C, dalam partikel atau fase diam dan pelarut yang bergerak atau fase gerak. Hal ini digambarkan dalam Gambar 2, untuk partikel tunggal dari kolom packing dan senyawa A dan C. Sebagian besar senyawa C pada kesetimbangan berada dalam fase diam, dan hanya sedikit fraksi yang berada dalam fase gerak. Situasi ini berkebalikan dengan senyawa A yang sebagian besar berada dalam fase gerak.

Gambar 2. Proses pemisahan diferensial

Kecepatan senyawa x bergerak melewati kolom (u_x) ditentukan oleh jumlah molekul yang berada dalam fase gerak pada setiap saat, karena molekul sampel tidak bergerak melewati kolom ketika mereka berada dalam fase diam. Oleh karena itu, senyawa seperti C, yang molekulnya lebih lama tinggal dalam fase diam, bergerak melewati kolom lebih lambat. Senyawa seperti A, yang molekulnya lebih banyak ditemukan dalam fase gerak pada setiap waktu, bergerak melewati kolom lebih cepat (u_a<u_c). Molekul pelarut atau fase gerak (S dalam Gambar 2) bergerak melewati kolom dengan laju paling cepat.

Migrasi diferensial atau gerakan setiap senyawa melewati kolom tergantung pada kesetimbangan distribusi setiap komponen dalam fase diam dan fase gerak. Oleh karena itu, migrasi diferensial ditentukan oleh variabel percobaan yang mempengaruhi distribusi, yaitu komposisi fase gerak, komposisi fase diam dan temperatur pemisahan. Jika kita ingin mempengaruhi migrasi diferensial untuk meningkatkan pemisahan, kita harus mengubah salah satu dari ketiga variabel ini.

Karakteristik kedua dari pemisahan kromatografi adalah penyebaran molekul sepanjang kolom, seperti A dalam Gambar 1. Dalam Gambar 1a, molekul A (segitiga) awalnya merupakan garis yang sangat sempit pada ujung atas kolom. Pada saat molekul tersebut bergerak melewati kolom, garis awal sedikitn demi sedikit mulai melebar, sampai pada (d) molekul A lebih menyebar dalam kolom. Tampak bahwa laju migrasi rata-rata setiap molekul A tidak sama. Perbedaan laju migrasi molekuler untuk molekul-molekul A tidak disebabkan oleh perbedaan kesetimbangan distribusi seperti dalam Gambar 2, tetapi lebih disebabkan oleh proses fisika atau proses laju. Salah satu proses yang menyebabkan penyebaran ini adalah difusi eddy.